Prima evidenza della modulazione epigenetica della metilazione genica umana da parte della microalga Aphanizomenon flos-aquae (AFA) nei percorsi correlati all’infiammazione nelle cellule intestinali
- Fiori Naselli,
- Sara Volpe,
- Paola Sofia Cardinale,
- Sabrina Micheli,
- Adele Cicio,
- Gabriele Dylan Scoglio,
- Roberto Chiarelli,
- Maria Grazia Zizzo,
- Pasquale Picone,
- Fabio Caradonna&
- Domenico Nuzzo
Epigenetica clinica volume 17 , Numero articolo: 44 ( 2025 ) Cita questo articolo
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Astratto
La microalga Aphanizomenon flos-aquae (AFA) ha attirato l’attenzione per i suoi potenziali benefici terapeutici in varie condizioni di salute, principalmente attraverso il suo utilizzo in formulazioni nutraceutiche. Mentre gli effetti biologici dell’AFA sono stati ampiamente studiati in modelli preclinici, inclusi sistemi murini, i suoi impatti nutrigenomici ed epigenetici rimangono poco esplorati. Questo studio indaga i potenziali meccanismi epigenetici dell’AFA, concentrandosi sulla sua capacità di modulare la metilazione del DNA, un processo di regolazione chiave nell’espressione genica. Nello specifico, abbiamo esaminato l’influenza dell’AFA sullo stato di metilazione dei geni che codificano le interleuchine pro-infiammatorie, poiché queste citochine svolgono un ruolo cruciale nella modulazione della risposta immunitaria e nell’infiammazione. Dato il noto impatto dell’AFA sui marcatori infiammatori, abbiamo mirato a determinare se gli effetti dell’AFA coinvolgono la modulazione diretta o indiretta dei modelli di metilazione del DNA nei geni associati all’infiammazione. I nostri risultati, presentati qui per la prima volta, rivelano la capacità dell’AFA di influenzare la metilazione del DNA, con implicazioni per il suo ruolo nei processi di regolazione cellulare. Questi risultati giustificano ulteriori indagini sui precisi meccanismi d’azione dell’AFA e sul suo potenziale nelle applicazioni cliniche mirate ai percorsi correlati all’infiammazione.
Introduzione
L’infiammazione cronica è fondamentale nella patogenesi di numerose malattie croniche, facilitandone l’insorgenza e la progressione [ 1 ]. Stimoli persistenti come infezioni, lesioni tissutali o squilibri metabolici innescano una risposta infiammatoria prolungata. A differenza dell’infiammazione acuta, che è un processo fisiologico che agisce contro agenti nocivi e promuove la riparazione, l’infiammazione cronica provoca danni ai tessuti, disregolazione immunitaria e rimodellamento anomalo dei tessuti [ 2 ]. Prove sempre più numerose suggeriscono che l’infiammazione cronica è un fattore comune nella patogenesi delle malattie croniche, tra cui disturbi cardiovascolari e neurodegenerativi, sindrome metabolica e alcuni tumori [ 2 , 3 , 3 , 4 ].
L’interazione dinamica tra mediatori infiammatori, cellule immunitarie e microambiente tissutale perpetua un ciclo di infiammazione e danno, sottolineando l’infiammazione come bersaglio terapeutico per la gestione delle malattie croniche. La modulazione dell’infiammazione attraverso processi epigenetici può essere una strategia promettente per ridurre l’infiammazione basale e prevenire varie patologie.
La metilazione del DNA, una modifica epigenetica essenziale che comporta l’aggiunta di un gruppo metilico ai residui di citosina dei dinucleotidi CpG, in genere determina il silenziamento genico e svolge un ruolo critico nello sviluppo, nella differenziazione e nella patogenesi della malattia [ 5 ]. L’infiammazione è emersa come un modulatore significativo dei modelli di metilazione del DNA, con crescenti prove che suggeriscono una relazione bidirezionale tra i due [ 6 , 7 ]. Nei tessuti infiammati, sono state osservate alterazioni nei modelli di metilazione del DNA, spesso caratterizzate da ipometilazione globale e ipermetilazione sito-specifica [ 8 ]. Questi cambiamenti possono influenzare l’espressione dei geni coinvolti nei percorsi infiammatori, tra cui citochine, chemiochine e recettori immunitari. Inoltre, modelli di metilazione del DNA aberranti sono stati implicati nella patogenesi di malattie infiammatorie, come l’artrite reumatoide, la malattia infiammatoria intestinale, l’obesità e la sindrome metabolica [ 9 ]. Al contrario, le alterazioni della metilazione del DNA possono anche contribuire alla regolazione delle risposte infiammatorie modulando l’espressione di geni infiammatori chiave [ 10 ].
Comprendere la complessa interazione tra metilazione del DNA e infiammazione è fondamentale per svelare i meccanismi molecolari alla base delle malattie infiammatorie e identificare potenziali bersagli per l’intervento terapeutico.
Negli ultimi anni, l’attenzione si è concentrata sugli approcci della medicina complementare che sfruttano il potere degli ingredienti naturali. Tra questi, l’Aphanizomenon flos-aquae (AFA), nota anche come “alga Klamath”, è emersa come un candidato notevole con un potenziale terapeutico promettente, in particolare nelle malattie croniche [ 11 , 12 ] e come polvere funzionale per gli alimenti [ 13 ].
L’AFA, una specie di cianobatteri che prospera nell’Upper Klamath Lake situato nell’Oregon, negli Stati Uniti, è venerata come una potenza nutrizionale e spesso consumata come un “superfood” [ 14 ]. Rinomato per la sua ricchezza nutrizionale, l’AFA è emerso come un componente di spicco in varie formulazioni nutraceutiche utilizzate in diverse patologie [ 15 , 16 ].
Studi hanno sottolineato gli effetti neuroprotettivi dell’AFA, insieme alla loro capacità di migliorare lo stress psicologico e migliorare il benessere in menopausa [ 11 ]. Inoltre, studi precedenti hanno evidenziato il potenziale terapeutico dell’AFA nei modelli murini, dimostrando la sua efficacia nell’attenuare le risposte infiammatorie e nel migliorare i risultati generali sulla salute, nonché nell’attenuare i componenti dell’infiammazione intestinale durante la colite sperimentale [ 12 ].
Sebbene i benefici clinici dell’AFA e dei suoi derivati stiano diventando sempre più evidenti, sono necessarie ulteriori indagini per chiarirne i meccanismi d’azione.
Poiché l’infiammazione indotta da IL1 β altera la metilazione dei promotori dei geni pro-infiammatori, [ 10 ], e considerando gli effetti benefici sulla metilazione del DNA osservati nelle malattie infiammatorie con nutraceutici dietetici [ 17 ], studiare l’AFA da un punto di vista nutrigenomico potrebbe offrire benefici significativi.
Questo studio esplora gli effetti nutrigenomici dell’AFA, concentrandosi in particolare sulla sua influenza sui modelli di metilazione del DNA dei geni correlati all’infiammazione. Utilizzando il DNA derivato dal tessuto del colon di ratti e utilizzando le cellule Caco-2 come sistema modello, abbiamo impiegato diversi paradigmi di trattamento per simulare la somministrazione di AFA sia successivamente a uno stimolo infiammatorio che contemporaneamente a uno stimolo infiammatorio. Questo approccio mira a chiarire se il meccanismo d’azione dell’AFA implichi una modulazione diretta o indiretta della metilazione del DNA. La nostra indagine cerca di scoprire nuove intuizioni sui percorsi molecolari attraverso cui l’AFA esercita i suoi effetti terapeutici, facendo luce sul suo potenziale come agente nutraceutico che mira alla regolazione epigenetica nei processi infiammatori.
Metodi
Solubilizzazione dell’AFA
L’estratto di AFA è stato gentilmente fornito da Nutrigea Research srl (Repubblica di San Marino). 5 mg di polvere di AFA sono stati solubilizzati in 5 mL di PBS (pH = 7,4; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 3 PO 4 ) per ottenere una concentrazione di 1 mg/mL. La soluzione è stata posta a 37 °C per 20 min, con una fase di vortice dopo 10 min. La frazione insolubile è stata rimossa mediante centrifugazione a 14.000 rpm per 30 min a 4 °C. Il surnatante è stato raccolto, filtrato utilizzando un filtro da 0,45 μm (Sartorius), suddiviso in aliquote (1 mL/fiala) e conservato a -20 °C. Chiameremo questa frazione “estratto di AFA”.
Animali
I tessuti del colon sono stati ottenuti da ratti maschi Wistar adulti (8-9 settimane di età, 250-300 g) assegnati casualmente a sei gruppi ( n = 5 animali/ciascuno): (1) gruppo di controllo (gruppo fittizio); (2) gruppo con colite (DNBS); (3) gruppo con colite + AphaMax ® (50 mg/Kg/giorno); (4) gruppo con colite + AphaMax ® (100 mg/Kg/giorno); (5) gruppo + AphaMax ® (50 mg/Kg/giorno); (6) gruppo + AphaMax ® (100 mg/Kg/giorno). Per indurre la colite è stata eseguita l’instillazione intracolonica (ic) di acido 2, 4-dinitrobenzensolfonico (DNBS; Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA), come già descritto [ 18 , 19 , 20 ]. Il protocollo sperimentale, seguito durante tutto lo studio, è stato condotto in conformità al D.Lgs 26/2014, seguendo i criteri delineati dalla Direttiva 2010/63/UE del Consiglio della Comunità Europea, riconosciuti e adottati dal Governo italiano e approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell’Università di Palermo e dal Ministero della Salute italiano (Autorizzazione n. 921/2018 – rilasciata Roma, Italia).
L’estratto di AFA (Nutrigea Research srl, Borgo Maggiore, Repubblica di San Marino) è stato sciolto in 0,5 mL di acqua e quindi sonicato (due volte per 60 s) immediatamente prima della somministrazione per via orale. Una soluzione di AFA da 50 o 100 mg/kg, che chiameremo AFA, è stata somministrata tramite somministrazione per via orale una volta al giorno per 14 giorni a partire da 7 giorni prima dell’induzione della colite (giorno 7).
In breve, i ratti sono stati tenuti a digiuno durante la notte e poi, sotto anestesia leggera con isoflurano all’1% (Merial Italia Spa, Assago, MI, Italia), il DNBS (15 mg) disciolto in una soluzione di etanolo al 50%, è stato depositato nel colon attraverso un catetere di plastica da 8 cm (PE90).
Per evitare azioni di reflusso, i ratti sono stati tenuti per 5 minuti in posizione di Trendelenburg e poi lasciati riprendere con cibo e acqua forniti. Il gruppo di controllo (gruppo fittizio) ha ricevuto instillazione ic di solo veicolo (50% di etanolo).
Nessuno dei ratti è morto durante lo studio o è stato escluso dallo studio per qualsiasi motivo. La valutazione del danno indotto dalla colite è stata eseguita riducendo al minimo la sofferenza degli animali, in modo cieco come precedentemente descritto [ 18 , 19 , 20 , 21 ].
Al termine del periodo di sperimentazione i ratti vennero uccisi e ne venne prelevato il colon per l’analisi della metilazione del DNA.
Colture cellulari e trattamenti
Nei nostri esperimenti, le concentrazioni di lavoro di AFA sono state fissate a 10 μg/mL (AFA10) e 200 μg/mL (AFA200). Il motivo di questa scelta è che gli studi pilota hanno dimostrato che AFA non era citotossico per le cellule Caco-2, qualunque fosse il trattamento sperimentale (dati non mostrati). Pertanto, abbiamo voluto testare sia le basse concentrazioni sia la concentrazione più alta che non presenta effetti tossici.
La linea cellulare Caco-2, derivata da un adenocarcinoma del colon umano (American Type Culture Collection, ATCC), è stata utilizzata tra i passaggi 20 e 30 e coltivata a 37 °C in un’atmosfera umidificata di CO2 / aria (5/95, v/v) in MEM di Dulbecco integrato con 25 mM HEPES, 10% (v/v) di siero bovino fetale (FBS) inattivato termicamente (Hyclone Perbio-Sciences), 1% di penicillina (10 9 103 U/mL)-streptomicina (10 mg/mL) e 1% (v/v) di aminoacidi non essenziali (NEAA) (Invitrogen) come descritto da [ 17 ]. Per gli esperimenti sono state utilizzate cellule differenziate, coltivate fino alla confluenza per 18-21 giorni in piastre da 12 pozzetti sostituendo il terreno di coltura ogni 3 giorni.
Per i trattamenti, le cellule sono state lavate con soluzione salina tampone fosfato, pH 7,4 (PBS) e ciascun trattamento è stato applicato alle cellule in un terreno di coltura contenente l’1% (v/v) di FBS.
Co-trattamento Le cellule sono state incubate con o senza 25 ng/mL di IL-1β (SignalChem) e con diverse concentrazioni di AFA per un tempo totale di 24 ore.
Pretrattamento Dopo l’incubazione, le cellule sono state preincubate con o senza 25 ng/mL di IL-1β (SignalChem) per 24 ore. Successivamente, il terreno di coltura è stato sostituito con terreno fresco con o senza AFA a diverse concentrazioni per 24 ore. Le cellule di controllo sono state incubate solo con terreno.
Dopo l’incubazione, i surnatanti sono stati raccolti e ne è stato estratto il DNA o l’RNA.
La citotossicità dell’estratto di AFA sulle cellule Caco-2 è stata verificata in studi pilota utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano (Sigma Chemical Co.) e il test MTT (Sigma Chemical Co.).
Isolamento del DNA genomico
L’isolamento del DNA genomico da cellule Caco-2 differenziate e tessuto del colon è stato effettuato con il kit PureLink Genomic DNA (Invitrogen, Regno Unito) come precedentemente descritto. Il DNA ottenuto è stato quantificato da NanoDrop ® ND-1000 [ 22 ].
Valutazione epigenomica della metilazione del DNA
Per valutare i possibili cambiamenti genomici nella metilazione del DNA, è stata eseguita la PCR arbitrariamente innescata sensibile alla metilazione (MeSAP-PCR) come precedentemente descritto da [ 17 ]. Questa è una tecnica che prevede la restrizione sensibile alla metilazione del DNA genomico, associata a due reazioni PCR consecutive per identificare modelli di metilazione alterati in siti diversi con una preferenza per quelli ricchi di GC. Questa tecnica, che fornisce una stima qualitativa e semi-quantitativa dei livelli di metilazione del DNA a livello genomico, ci consente di evidenziare differenze nella metilazione tra i genomi.
Valutazione dello stato di metilazione del promotore genico mediante PCR con endonucleasi di restrizione sensibile alla metilazione (MSRE-PCR)
Per l’analisi dello stato di metilazione del promotore genico, è stata eseguita la MSRE-PCR come descritto da Bellavia et al. [ 23 ]. Il DNA genomico delle cellule differenziate è stato digerito separatamente con endonucleasi di restrizione sensibili alla metilazione HpaII/MspI e HhaI (MSRE) e amplificato mediante PCR in presenza di primer specifici per i siti cg dei geni IL6, IL8 e IL10 , importanti per la loro espressione [ 24 , 25 , 26 ]. Sono stati studiati sette siti per il gene IL6 (quattro per HhaI MSRE: IL6/1, IL6/2, IL6/4, IL6/6 e tre per la coppia HpaII/MspI MSRE: IL6/3, IL6/5, IL6/7), due siti per il gene IL8 (IL8/1 e IL8/2 per la coppia HpaII/MspI MSRE) e tre siti per il gene IL10 (due per la coppia HpaII/MspI MSRE: IL10/1, IL10/3 e uno per HhaI MSRE: IL10/2).
I primer sono stati progettati utilizzando il software bioinformatico BLAST ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.igi ).
Le sequenze dei primer e le impostazioni PCR sono elencate nei file supplementari Tabelle 1–8.
Estrazione dell’RNA e PCR in tempo reale
Le cellule Caco-2 sono state coltivate in piastre a 6 pozzetti e trattate con o senza 25 ng/mL di IL-1β seguendo il modello di co-trattamento o pre-trattamento come sopra menzionato. L’RNA è stato estratto utilizzando il disponibile in commercio (Qiagen GmbH Hilden, Germania), secondo le istruzioni del produttore. L’RNA totale è stato retrotrascritto in cDNA utilizzando il kit QuantiTect Reversion Trascription (Qiagen GmbH Hilden, Germania). La RT-QPCR è stata eseguita in piastre a 96 pozzetti utilizzando il sistema Step-One Plus Real-Time PCR (Applied Biosystem). Per la PCR quantitativa in tempo reale SYBR ® Green, utilizzando il kit Quantinova SYBR ® Green PCR, Quantitect ® Primer Assay è stato acquistato da Qiagen.
I cambiamenti relativi nell’espressione genica tra i campioni di controllo e quelli trattati sono stati determinati con il metodo ΔΔ C t . I valori finali sono stati espressi come variazione di piega.
Test ELISA
I livelli di citochine pro-infiammatorie (IL-6 e IL-8) e il livello di citochina anti-infiammatoria IL-10 sono stati quantificati utilizzando kit ELISA specifici (SEA079Hu, Cloud-Clone Corp., Wuhan, Cina; orb437375, Biorbyt Biotechnology Co., Wuhan, Cina) (SEA056Hu, Cloud-Clone Corp., Wuhan, Cina). I test sono stati eseguiti utilizzando supernatanti di coltura di cellule Caco-2 differenziate trattate con IL1β e AFA10/200 μg/mL per 24 ore, seguendo le istruzioni del produttore. L’assorbanza è stata infine misurata in un lettore di micropiastre (Glomax, Promega Milano, Italia) a 450 nm.
Analisi statistica
L’analisi statistica è stata condotta utilizzando Prism per Windows, (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Abbiamo impiegato l’analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) seguita dal confronto multiplo di Tukey. È stato utilizzato un livello di significatività di p < 0,05 per determinare differenze statisticamente significative. I dati sono presentati come medie ± deviazione standard (DS).
Risultati
Metilazione del DNA del tessuto del colon del ratto
Come precedentemente dimostrato, il trattamento con AFA è in grado di ridurre le condizioni infiammatorie durante la colite sperimentale nei ratti [ 12 ]. Vogliamo valutare se gli effetti antinfiammatori dell’AFA debbano essere correlati a un possibile meccanismo epigenetico come la metilazione del DNA.
I nostri dati hanno mostrato (Fig. 1 A–C) nel tessuto del colon del gruppo DNBS una demetilazione globale del DNA rispetto al gruppo fittizio; il trattamento dei gruppi con colite con AFA50 o AFA100 porta a un’ipermetilazione del DNA rispetto al gruppo di controllo, in particolare il gruppo trattato con AFA50 e AFA100 ha mostrato una leggera ipermetilazione del DNA rispetto al gruppo fittizio (Fig. 1 C).
Figura 1
Impronta digitale rappresentativa del MeSAP-DNA e densitometria a scansione relativa A , B che indicano la metilazione del DNA genomico del tessuto del colon di ratto trattato con: A (da sinistra) gruppo fittizio (CTR); acido 2,4-dinitrobenzene solfonico (DNBS); acido 2,4-dinitrobenzene solfonico + AFA 50 mg/Kg/giorno (DNBS + AFA50); B (da sinistra) acido 2,4-dinitrobenzene solfonico + AFA 100 mg/Kg/giorno (DNBS + AFA100); AFA 50 mg/Kg/giorno (AFA50); AFA 100 mg/Kg/giorno (AFA100); e rappresentazioni grafiche relative dell’analisi densitometrica La variazione del pattern di banda C , in termini di intensificazione/indebolimento e comparsa/scomparsa, è stata valutata mediante scansione densitometrica del DNA monodigerito (MD) rispetto al DNA doppiamente digerito (DD)
Effetti epigenetici dell’AFA sulla metilazione del DNA nelle cellule Caco-2 differenziate
Per indagare se la metilazione del DNA subisce alterazioni a seguito di trattamenti con IL1β e AFA, abbiamo eseguito la MeSAP-PCR (Fig. 2 A, C , E ), utilizzando i modelli sperimentali precedentemente descritti. I nostri risultati rivelano cambiamenti significativi nei modelli di metilazione del DNA in risposta a entrambi i trattamenti con IL1β e AFA. Come mostrato nella Fig. 2 B, il trattamento con IL1β per 24 ore ha indotto una leggera ipometilazione rispetto al controllo. Il co-trattamento simultaneo con IL1β e AFA10 ha portato a ipermetilazione, mentre il co-trattamento con IL1β e AFA200 ha portato a ipometilazione. Al contrario, dopo 24 ore di pre-trattamento con IL1β seguito da DMEM fresco per altre 24 ore (Fig. 2 D), l’ipometilazione del DNA è stata indotta nelle cellule Caco-2. Tuttavia, quando il pretrattamento con IL1β è stato seguito dal trattamento con AFA10 e AFA200 per 24 ore, è stato osservato un aumento della metilazione. Il trattamento con AFA10 o AFA200 da solo per 24 ore in cellule Caco-2 differenziate ha indotto una leggera ipermetilazione (Fig. 2 F).
Figura 2
Impronta digitale rappresentativa del MeSAP-DNA e densitometria a scansione relativa ( A , C , E ), che indicano la metilazione del DNA genomico delle cellule differenziate Caco-2: A (da sinistra) non trattato (CTR), 25 ng/mL IL-1β 24 h (IL-1β 24 h), co-trattamento 25 ng/mL IL-1β 24 h + 10 ng/μL 24 h (co-trattamento IL-1β + AFA10), co-trattamento 25 ng/mL IL-1β 24 h + 200 ng/μL 24 h (co-trattamento IL-1β + AFA200); C (da sinistra) 25 ng/mL IL-1β 24 h + solo DMEM 24 h (IL-1β + DMEM), 25 ng/mL IL-1β 24 h + 10 ng/μL 24 h (IL-1β + AFA10), 25 ng/mL IL-1β 24 h + 200 ng/μL 24 h (IL-1β + AFA200); E (da sinistra) non trattato (CTR), trattamento con AFA10 ng/μL 10 ng/μL 24 h (AFA10), AFA 200 ng/μL 24 h (AFA200) e rappresentazioni grafiche relative dell’analisi densitometrica per i co-trattamenti B o i successivi pre-trattamenti D o il trattamento delle cellule Caco-2 differenziate con AFA10 e AFA200 F . La variazione del pattern di banda, in termini di intensificazione/indebolimento e comparsa/scomparsa, è stata valutata mediante scansione densitometrica del DNA monodigerito (MD) rispetto al DNA doppiamente digerito (DD)
Metilazione del DNA nella regione promotore dei geni correlati all’infiammazione
Per valutare se l’AFA avesse un effetto sulla metilazione della regione promotore di alcuni geni associati al processo infiammatorio, abbiamo studiato la regione a monte dei geni pro-infiammatori e antinfiammatori IL6 , IL8 e IL10 nelle cellule Caco-2 co-trattate con IL1β e AFA per 24 ore e nelle cellule pre-trattate con IL1β per 24 ore e successivo trattamento con AFA a diverse concentrazioni in terreni freschi, per altre 24 ore.
Gene IL6
Nel promotore del gene IL6 (Fig. 3 ) abbiamo esaminato lo stato di metilazione di sette siti di restrizione contenenti CpG metilabili. Per lo schema sperimentale dei co-trattamenti, questo studio ha mostrato che quando abbiamo somministrato IL1β per 24 ore, ha indotto una significativa demetilazione nei siti IL6/1, IL6/3 e IL6/6. Solo nel sito IL6/5 IL1β ha indotto ipermetilazione rispetto al controllo non trattato. Il trattamento successivo con AFA ha ripristinato la metilazione dei siti IL6/1 e IL6/6 in modo dose-dipendente a livelli comparabili al controllo non trattato. Per il sito IL6/3, AFA10 non ha indotto un cambiamento nella metilazione rispetto al trattamento con IL1β, mentre AFA200 ha indotto ipermetilazione di questo sito rispetto al trattamento con IL1β. Al contrario, AFA200 ha indotto ipometilazione nei siti IL6/4 e IL6/7.
Figura 3
MSRE-PCR rivela lo stato di metilazione dei siti CG nella regione del promotore del gene IL6, da cellule Caco-2 trattate con IL-1β, co-trattate con IL-1β + AFA10 e IL-1β + AFA200. La densitometria delle bande è mostrata da istogrammi, che rappresentano la media di tre esperimenti. Analisi statistica eseguita con analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) e test di comparazione multipla di Tukey. Le differenze sono state considerate significative a * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005
Per i pretrattamenti, lo studio della metilazione del sito CpG nel promotore del gene IL6 (Fig. 4 ) ha mostrato che il trattamento con IL1β per 24 h seguito da DMEM fresco ha indotto la demetilazione nei siti IL6/2 e IL6/5 ma non ha influenzato lo stato di metilazione dei siti IL6/3, IL6/4 e IL6/7, confermando quanto osservato anche da Caradonna et al. [ 10 ]. Quando le cellule sono state trattate con AFA10 seguito da insulto IL1β, è stato osservato un aumento della metilazione rispetto al trattamento con IL1β da solo in tutti i siti analizzati. Tuttavia, il trattamento con AFA200 ha indotto ipometilazione rispetto al controllo non trattato in tutti i siti analizzati.
Figura 4
La MSRE-PCR rivela lo stato di metilazione dei siti CG nella regione del promotore del gene IL6, da cellule Caco-2 trattate con IL-1β, successivamente trattate con AFA10 e AFA200. La densitometria delle bande è mostrata da istogrammi, che rappresentano la media di esperimenti triplicati con risultati simili. Analisi statistica eseguita con analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) e test di comparazione multipla di Tukey. Le differenze sono state considerate significative a * p < 0,05
Gene IL8
Lo studio della metilazione del sito CpG nel promotore del gene IL8 (Fig. 5 ) in cellule co-trattate con IL1β e AFA per 24 ore a diverse concentrazioni ha dimostrato che il sito IL8/1 subisce una leggera demetilazione in seguito al trattamento con AFA a entrambe le concentrazioni rispetto al controllo non trattato, che è già moderatamente metilato. Solo AFA10 è in grado di indurre la demetilazione del sito IL8/2, che è altamente ipermetilato nel controllo non trattato.
Figura 5
MSRE-PCR rivela lo stato di metilazione dei siti CG nella regione del promotore del gene IL8, da cellule Caco-2 trattate con IL-1β, co-trattate con IL-1β + AFA10 e IL-1β + AFA200. La densitometria delle bande è mostrata da istogrammi, che rappresentano la media di esperimenti triplicati con risultati simili. Analisi statistica eseguita con analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) e test di comparazione multipla di Tukey. Le differenze sono state considerate significative a * p < 0,05, ** p < 0,01
Per i pretrattamenti con o senza IL-1β, come illustrato nella Fig. 6 , IL1β ha indotto una riduzione della metilazione in entrambi i siti CpG analizzati nel promotore del gene IL8 . Il trattamento successivo con AFA a entrambe le concentrazioni testate non ha indotto ulteriori cambiamenti significativi nella metilazione di questi due siti rispetto al trattamento con IL1β da solo.
Figura 6
MSRE-PCR rivela lo stato di metilazione dei siti CG nella regione del promotore del gene IL8, da cellule Caco-2 trattate con IL-1β, successivamente trattate con AFA10 e AFA200. La densitometria delle bande è mostrata da istogrammi, che rappresentano la media di esperimenti triplicati con risultati simili. Analisi statistica eseguita con analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) e test di comparazione multipla di Tukey. Le differenze sono state considerate significative a * p < 0,05, ** p < 0,01
Gene IL10
Nella regione del promotore del gene IL10 , che codifica una citochina antinfiammatoria, abbiamo esaminato due siti CpG. La metilazione dei siti CpG analizzati nel promotore del gene IL10 (Fig. 7 ) non è stata influenzata dai trattamenti con IL1β o AFA10. Solo AFA200 ha indotto una riduzione non significativa della metilazione nei due siti analizzati.
Figura 7
MSRE-PCR rivela lo stato di metilazione dei siti CG nella regione del promotore del gene IL10, da cellule Caco-2 trattate con IL-1β, co-trattate con IL-1β + AFA10 e IL-1β + AFA200. La densitometria delle bande è mostrata da istogrammi, che rappresentano la media di esperimenti triplicati con risultati simili. Analisi statistica eseguita con analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) e test di comparazione multipla di Tukey. Le differenze sono state considerate significative a * p < 0,05
Invece, i risultati dei pretrattamenti con IL1β dimostrano una leggera demetilazione in entrambi i siti CpG rispetto alle cellule non trattate, come mostrato in Fig. 8. È interessante notare che il trattamento con AFA10 in seguito a insulto con IL1β induce un aumento della metilazione rispetto al controllo non trattato o alle cellule trattate con IL1β. AFA200 sembra ridurre la metilazione di IL10/2.
Figura 8
MSRE-PCR rivela lo stato di metilazione dei siti CG nella regione promotore del gene IL10, da cellule Caco-2 trattate con IL-1β, successivamente trattate con AFA10 e AFA200. La densitometria delle bande è mostrata da istogrammi, che rappresentano la media di esperimenti triplicati con risultati simili
Espressione delle citochine
I livelli di espressione genica delle citochine IL6 e IL8 sono stati valutati in seguito a vari trattamenti e confrontati con cellule Caco-2 di controllo non trattate. La Figura 9 A mostra che il co-trattamento di IL1β e AFA aumenta l’espressione di IL6 in modo dose-dipendente. Inoltre, mentre il pre-trattamento con IL1β per 24 h sostituito con mezzo fresco ha aumentato l’espressione di IL6, il successivo trattamento con AFA10 aumenta ulteriormente in modo significativo l’espressione di IL6 rispetto al controllo non trattato (Fig. 9 B). Nelle Fig. 9 C e D , sono mostrati i livelli di IL-6 rilasciati nel mezzo, come valutato dal test ELISA. Come osservato, AFA aumenta in modo significativo il rilascio di IL-6 in seguito all’insulto infiammatorio. Al contrario, il co-trattamento con IL-1β e AFA non altera in modo significativo il rilascio di IL-6.
Figura 9
Espressione del gene IL6 in cellule differenziate Caco-2 trattate con IL-1β e AFA. A Istogramma che mostra i livelli di mRNA di IL6 dopo co-trattamenti con IL-1β e AFA10/AFA200; B Istogramma che mostra i livelli di mRNA di IL6 dopo trattamenti con IL-1β per 24 ore dopo l’incubazione, il terreno di coltura è stato sostituito con terreno fresco con o senza AFA10/AFA200. C Istogramma che mostra i livelli di IL6 rilasciati dopo co-trattamenti con IL-1β e AFA10/AFA200; D Istogramma che mostra i livelli di IL6 rilasciati dopo pre-trattamenti con IL-1β per 24 ore e quindi trattamento con o senza AFA10/AFA200. I dati negli istogrammi sono presentati come media di esperimenti triplicati. Analisi statistica eseguita con analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) e test di confronti multipli di Tukey. Le differenze sono state considerate significative a * p < 0,05, ** p < 0,01
Allo stesso modo, è stata analizzata l’espressione di IL8. Come si vede nella Fig. 10 A, il trattamento con IL1β per 24 h aumenta significativamente l’espressione di IL8. Tuttavia, il co-trattamento con AFA10 e AFA200 riduce significativamente l’espressione di IL8. È stato anche studiato il rilascio di citochine nel mezzo e, come mostrato nella Fig. 10 C, il trattamento con IL-1β da solo per 24 h ha aumentato il rilascio di IL8 nel mezzo. Tuttavia, quando le cellule sono state co-trattate con AFA insieme all’insulto infiammatorio, è stata osservata una riduzione nel rilascio della citochina pro-infiammatoria IL8. Allo stesso modo, il pre-trattamento per 24 h con IL1β seguito dalla sostituzione con mezzo fresco per le successive 24 h aumenta l’espressione di IL8 rispetto al controllo non trattato. Il trattamento con AFA10 dopo il pre-trattamento con IL1β riduce l’espressione di IL8 ai livelli del controllo non trattato. Nessun effetto è indotto dal trattamento con AFA200 (Fig. 10 B). La stessa tendenza (sebbene non statisticamente significativa) può essere osservata anche nel rilascio della citochina IL8 nel mezzo a seguito del trattamento con IL1β e del successivo trattamento con AFA (Fig. 10 D).
Figura 10
Espressione del gene IL8 in cellule differenziate Caco-2 trattate con IL-1β e AFA. A Istogramma che mostra i livelli di mRNA di IL8 dopo co-trattamenti con IL-1β e AFA 10/AFA200; B Istogramma che mostra i livelli di mRNA di IL8 dopo trattamenti con IL-1β per 24 ore dopo l’incubazione, il terreno di coltura è stato sostituito con terreno fresco con o senza AFA10/AFA200. C Istogramma che mostra i livelli di IL8 rilasciati dopo co-trattamenti con IL-1β e AFA10/AFA200; D Istogramma che mostra i livelli di IL8 rilasciati dopo trattamenti con IL-1β per 24 ore dopo l’incubazione, il terreno di coltura è stato sostituito con terreno fresco con o senza AFA10/AFA200. I dati negli istogrammi sono presentati come media di esperimenti triplicati. Analisi statistica eseguita con ANOVA unidirezionale e test di confronti multipli di Tukey. Le differenze sono state considerate significative a * p < 0,05
Per quanto riguarda i livelli di espressione di IL10, i livelli basali di questa citochina erano così bassi che non è stato possibile rilevarla con nessuna delle tecniche utilizzate.
Espressione DNMT
Uno dei meccanismi per stabilire variazioni nei modelli di metilazione che possono essere associati all’istituzione di una condizione fenotipica come l’infiammazione è l’aumento dell’attività o della quantità di DNA metiltransferasi (DNMT). Le DNMT sono enzimi responsabili della metilazione del DNA. Per questo motivo, abbiamo studiato l’espressione delle DNMT nelle cellule Caco-2 dopo il co-trattamento con IL1β e AFA a diverse concentrazioni (Fig. 11 A) o trattate con lo stimolo infiammatorio e con AFA (Fig. 11 B).
Figura 11
Espressione del gene DNMT3A in cellule differenziate Caco-2 trattate con IL-1β e AFA. A Istogramma che mostra i livelli di mRNA DNMT3A dopo co-trattamenti con IL-1β e AFA 10/AFA200; B Istogramma che mostra i livelli di mRNA DNMT3A dopo trattamenti con IL-1β e AFA10/AFA200. I dati negli istogrammi sono presentati come media di tre esperimenti con risultati simili. Analisi statistica eseguita con ANOVA unidirezionale e test di comparazione multipla di Tukey. Le differenze sono state considerate significative a * p < 0,05
Il trattamento con IL1β da solo per 24 ore ha indotto un aumento nell’espressione di DNMT3A, che è stato riportato ai livelli di controllo dal co-trattamento con IL1β e AFA a qualsiasi concentrazione (Fig. 11 A). Invece, il trattamento delle cellule Caco-2 con IL1β per 24 ore seguito dalla sostituzione con mezzo fresco ha indotto una significativa riduzione nell’espressione di DNMT3A rispetto al controllo non trattato (Fig. 11 A). Il trattamento con IL1β per 24 ore seguito dal successivo trattamento con AFA10 ha ulteriormente ridotto l’espressione di DNMT3A. Tuttavia, il successivo trattamento con AFA200 non sembrava avere un effetto aggiuntivo rispetto al trattamento con IL1β da solo (Fig. 11 B).
La Figura 12 mostra che, indipendentemente dalle condizioni di trattamento, i livelli di espressione di DNMT3B aumentano in seguito al trattamento con IL1β da solo o IL1β e AFA a qualsiasi concentrazione. Nello specifico, nella Figura 12 A, viene mostrato un aumento significativo nei livelli di espressione di DNMT3B in seguito al trattamento con IL1β per 24 ore e in modo dose-dipendente in seguito al co-trattamento con IL1β e AFA.
Figura 12
Espressione del gene DNMT3B nelle cellule differenziate Caco-2 trattate con IL-1β e AFA. A Istogramma che mostra i livelli di mRNA di DNMT3B dopo i co-trattamenti con IL-1β e AFA 10/AFA200; B Istogramma che mostra i livelli di mRNA di DNMT3B dopo i trattamenti con IL-1β e AFA10/AFA200. I dati negli istogrammi sono presentati come media di esperimenti triplicati con risultati simili. Analisi statistica eseguita con ANOVA unidirezionale e test di comparazione multipla di Tukey. Le differenze sono state considerate significative a * p < 0,05
Nel co-trattamento di IL1β e AFA, è stato osservato che il trattamento delle cellule Caco-2 con IL1β da solo ha indotto un aumento dei livelli di DNMT1. Tuttavia, il co-trattamento di IL1β e AFA a diverse concentrazioni ha ripristinato i livelli di espressione di DNMT1 a quelli del controllo non trattato (Fig. 13 A). Il trattamento con lo stimolo infiammatorio (IL1β) per 24 ore seguito da mezzo fresco ha indotto un leggero aumento dell’espressione di DNMT1. Questo si è invertito ai livelli di controllo quando le cellule sono state trattate con AFA10. Il trattamento con AFA200, d’altra parte, non ha ridotto l’espressione di DNMT1 indotta da IL1β (Fig. 13 B).
Figura 13
Espressione del gene DNMT1 nelle cellule differenziate Caco-2 trattate con IL-1β e AFA. A Istogramma che mostra i livelli di mRNA DNMT1 dopo i co-trattamenti con IL-1β e AFA10/AFA200; B Istogramma che mostra i livelli di mRNA DNMT1 dopo i trattamenti con IL-1β e AFA10/AFA200. I dati negli istogrammi sono presentati come media di esperimenti triplicati con risultati simili. Analisi statistica eseguita con ANOVA unidirezionale e test di comparazione multipla di Tukey. Le differenze sono state considerate significative a * p < 0,05, ** p < 0,01
Discussione
L’infiammazione cronica promuove lo sviluppo e la progressione della malattia causando danni tissutali prolungati, disregolazione immunitaria e rimodellamento tissutale anomalo [ 1 ]. Stimoli persistenti come infezioni o lesioni innescano un’infiammazione sostenuta, che porta a malattie cardiovascolari e neurodegenerative, sindrome metabolica e tumori [ 2 ]. In questo contesto, l’infiammazione è un obiettivo terapeutico chiave per molte malattie [ 3 , 4 ].
La metilazione del DNA è un regolatore chiave dell’espressione genica e della stabilità genomica, che spesso porta al silenziamento genico [ 5 ]. L’infiammazione può influenzare i modelli di metilazione del DNA [ 6 , 7 ]. I tessuti infiammati mostrano ipometilazione globale e ipermetilazione sito-specifica, che colpisce i geni coinvolti nei percorsi infiammatori, il che contribuisce allo sviluppo di malattie [ 8 ]. Comprendere questa interazione è fondamentale per identificare obiettivi terapeutici.
Di recente, i composti naturali sono stati esplorati per il loro potenziale terapeutico. L’AFA, una specie di cianobatteri dell’Upper Klamath Lake, Oregon, è riconosciuta come un “superfood” per il suo valore nutrizionale [ 14 , 27 ]. Gli studi evidenziano gli effetti neuroprotettivi dell’AFA, la riduzione dello stress e i miglioramenti del benessere in menopausa [ 11 ]. L’AFA attenua anche le condizioni infiammatorie durante la colite sperimentale nel modello murino [ 12 ]. Dato l’impatto documentato dell’AFA sull’infiammazione, ipotizziamo che l’AFA possa esercitare i suoi effetti attraverso la modulazione dei modelli di metilazione del DNA. Puntiamo a scoprire nuove intuizioni sui meccanismi terapeutici dell’AFA, sottolineando il suo potenziale come agente nutraceutico per la regolazione epigenetica nei processi infiammatori.
Questo studio indaga gli effetti nutrigenomici ed epigenetici dell’AFA, concentrandosi sulla sua influenza sui modelli di metilazione del DNA dei geni correlati all’infiammazione. I dati precedenti ottenuti dal tessuto del colon di ratti trattati con AFA ci hanno spinto a indagare ulteriormente il meccanismo d’azione dell’AFA e a determinare se potesse essere considerato un modulatore della metilazione del DNA. Infatti, analizzando la metilazione del DNA del tessuto del colon di ratti (Fig. 1 A, B ), abbiamo osservato che la colite indotta da DNBS ha portato alla demetilazione rispetto al gruppo fittizio. Tuttavia, il trattamento con AFA ha portato a ipermetilazione rispetto al gruppo fittizio (Fig. 1 C). Nello specifico, il trattamento con AFA da solo porta a un aumento della metilazione globale del DNA, inoltre, quando somministrato in presenza di un insulto infiammatorio, AFA100 è in grado di determinare un maggiore effetto ipermetilante. Ciò è probabile perché la sua azione contribuisce probabilmente a regolare altri meccanismi che influenzano lo stato di metilazione globale del DNA, come l’espressione di microRNA.
Utilizzando le cellule Caco-2 come sistema modello, abbiamo impiegato diversi modelli di trattamento per rappresentare la somministrazione di AFA che si verifica simultaneamente a uno stimolo infiammatorio o il trattamento con AFA a seguito di uno stimolo infiammatorio (modello di infiammazione cronica). Abbiamo osservato che diversi modelli di trattamento hanno mostrato effetti variabili di AFA sulla modulazione della metilazione globale del DNA. La differenza nella tempistica della somministrazione di AFA può influenzare la sua capacità di modulare il panorama della metilazione, portando alla variabilità osservata nei modelli di metilazione del DNA. In particolare, il trattamento con IL1β per 24 ore ha indotto una leggera ipometilazione rispetto al controllo. Il co-trattamento simultaneo con IL1β e AFA10 ha portato a ipermetilazione. Al contrario, il co-trattamento con IL1β e AFA200 ha portato a ipometilazione (Fig. 2 B). Analogamente, il trattamento con IL1β per 24 ore seguito da mezzo fresco per altre 24 ore ha portato a demetilazione globale del DNA. Tuttavia, quando AFA10 e AFA200 sono stati aggiunti dopo lo stimolo infiammatorio (IL1β per 24 ore), è stata indotta un’ipermetilazione globale rispetto al controllo non trattato (Fig. 2 D). Questi risultati sono coerenti con la letteratura esistente e confermano la relazione tra stato infiammatorio e cambiamenti nel modello di metilazione del DNA [ 28 , 29 , 30 ].
In particolare, l’infiammazione induce la demetilazione globale del DNA, rendendolo più instabile. Qui, la maggior parte dei trattamenti con AFA ripristina lo stato di metilazione, contrastando gli effetti infiammatori indotti e probabilmente portando a un DNA più stabile. Inoltre, è stato osservato che solo AFA200 co-trattato con IL1β, ha indotto ipometilazione. Questo fenomeno suggerisce un’incapacità di AFA 200 di mitigare l’impatto dello stimolo infiammatorio simultaneo sulla metilazione del DNA. Curiosamente, questa combinazione mostra un effetto additivo per quanto riguarda la metilazione in contrasto con lo stimolo infiammatorio da solo. Per quanto ne sappiamo, nessuno studio fino ad oggi ha dimostrato l’effetto delle microalghe sulla metilazione del DNA umano, evidenziando un’interferenza tra i regni animale e vegetale. Con questo lavoro, siamo i primi ad affermare che le microalghe possono interagire e modulare la metilazione del DNA umano/animale, dimostrando il loro ruolo funzionale nell’interazione tra regni.
Abbiamo anche studiato la metilazione dei promotori di alcuni geni che codificano interleuchine pro-infiammatorie e antinfiammatorie, poiché è stato dimostrato che queste sono soggette a regolazione epigenetica [ 10 ]. Abbiamo esaminato singoli siti di metilazione, rivelando i diversi effetti dell’AFA a seconda del metodo di trattamento sperimentale. In particolare, una panoramica del gene IL6 (Fig. 3 ) suggerisce che in caso di co-trattamenti (lo stimolo infiammatorio e l’AFA a diverse concentrazioni), l’AFA influisce significativamente sulla metilazione del DNA in siti specifici rispetto al solo stimolo infiammatorio. Ipotizziamo che alcuni siti di metilazione nel promotore del gene IL6 presentino diverse sensibilità agli agenti esterni, che interagiscono in qualche modo con il macchinario epigenetico. Infatti, a seguito del co-trattamento IL1β-AFA, si osserva un aumento dell’espressione del gene IL6 (Fig. 9 A).
Vale la pena notare che IL-6 ha un duplice ruolo, agendo sia come citochina pro-infiammatoria che come citochina antinfiammatoria. Gli effetti pro-infiammatori di IL-6 sono mediati principalmente attraverso la segnalazione classica tramite il recettore IL-6 legato alla membrana (mIL-6R), che porta all’attivazione di percorsi infiammatori. Al contrario, IL-6 può anche esibire proprietà antinfiammatorie attraverso la trans-segnalazione tramite recettori IL-6 solubili (sIL-6R), promuovendo la produzione di molecole antinfiammatorie [ 31 , 32 ]. Dati i comprovati effetti antinfiammatori di AFA, l’aumento dell’espressione di IL6 a seguito del trattamento con AFA (Fig. 9 A, B ) indipendentemente dal fatto che sia stato co-trattato con lo stimolo infiammatorio o aggiunto in seguito, ci porta a credere che probabilmente promuova il ruolo antinfiammatorio già dimostrato per IL6.
Per il gene IL8 , il co-trattamento con AFA10 e IL1β riduce significativamente la metilazione in un solo sito di metilazione, mentre AFA200 non induce alcun cambiamento rispetto al solo stimolo infiammatorio (Fig. 5 ). Tuttavia, i livelli di espressione genica sono significativamente ridotti dal co-trattamento con AFA a entrambe le concentrazioni rispetto alle cellule trattate con solo IL1β (Fig. 10 A). Ciò suggerisce che meccanismi oltre la metilazione del DNA sono coinvolti nell’effetto antinfiammatorio esercitato da AFA.
Modificando l’impostazione sperimentale, l’impatto dell’AFA sulla metilazione del DNA è variato. In particolare, replicando uno stimolo infiammatorio acuto seguito da risoluzione (IL1B + DMEM) o trattamento con AFA somministrato dopo stimolazione post-infiammatoria. Per quanto riguarda lo studio dei siti metilati del promotore del gene IL6 (Fig. 4 ) in seguito al trattamento con IL1β per 24 ore e successiva sostituzione con mezzo fresco, la demetilazione è stata osservata solo in determinati siti (IL6/2 e IL6/5) (Fig. 4 ). La successiva somministrazione di AFA10 ha indotto costantemente ipermetilazione in tutti i siti metilati rispetto al controllo non trattato. Tuttavia, il trattamento con AFA200 ha ridotto la metilazione in molti siti rispetto al controllo non trattato (Fig. 4 ). Questo comportamento non uniforme dell’AFA ci ha spinto a considerare le potenziali implicazioni. I risultati complessivi suggeriscono che, quando l’AFA viene somministrato contemporaneamente allo stimolo infiammatorio, non riesce a contrastare gli effetti dell’IL1β (Fig. 3 , 5 ). Tuttavia, quando AFA10 è stato somministrato in seguito allo stimolo infiammatorio, che non era più presente, è stato in grado di contribuire al ripristino della metilazione (Fig. 4 , 6 ). Inoltre, questi ultimi risultati hanno dimostrato un effetto dose-dipendente di AFA, indicando che il suo risultato dipende dalla concentrazione a cui viene somministrato.
Considerando che uno dei fattori che contribuiscono a un modello alterato di metilazione del DNA è un cambiamento nell’espressione di DNMT [ 22 ], abbiamo mirato a studiare l’effetto di AFA sull’espressione di DNMT in entrambi i modelli sperimentali studiati. Abbiamo analizzato i livelli di espressione di DNMT responsabili della metilazione de novo del DNA (DNMT3A e DNMT3B), i cui substrati sono simmetricamente non metilati su entrambi i filamenti di DNA. Questi risultati, tuttavia, mostrano un comportamento diverso di AFA a seconda del modello sperimentale. Da un lato, il co-trattamento di AFA con lo stimolo infiammatorio (Fig. 11 A), ha ridotto l’espressione di DNMT3A, rispetto al trattamento con il solo stimolo infiammatorio. Allo stesso modo, quando AFA è stato aggiunto dopo lo stimolo infiammatorio (Fig. 11 B), ha ridotto significativamente l’espressione di DNMT3A. D’altro canto, AFA è stato in grado di aumentare significativamente l’espressione di DNMT3B quando aggiunto in co-trattamento con IL1β (Fig. 12 A), o quando AFA è stato somministrato dopo lo stimolo infiammatorio (Fig. 12 B). Sebbene AFA aumenti l’espressione (sia i dati sui livelli genici che proteici sono mostrati nei file supplementari) di DNMT3B, l’attività di questi enzimi potrebbe anche essere regolata da AFA. In questo studio, abbiamo osservato (Fig. 1 , 2 ) un aumento della metilazione globale del DNA insieme a un aumento dell’espressione di DNMT3B. Pertanto, ipotizziamo che, almeno per DNMT3B, AFA possa migliorare la sua espressione aumentando così anche la sua attività enzimatica complessiva, consentendogli di produrre cambiamenti rilevabili nella metilazione globale del DNA. Abbiamo quindi analizzato DNMT1 (Fig. 13 ), responsabile del mantenimento della metilazione del DNA, e abbiamo osservato un aumento di DNMT1 dopo il trattamento con il solo stimolo infiammatorio (Fig. 13 A). Tuttavia, il co-trattamento con AFA ha ridotto l’espressione di DNMT1, riportandola a livelli simili al controllo non trattato (Fig. 13 A). Il trattamento con AFA a seguito di IL1β non ha alterato i livelli di DNMT1 rispetto al controllo non trattato (Fig. 13 B).
Questi risultati ci portano a due diverse considerazioni. Le diverse azioni dell’AFA verso i diversi DNMT (di mantenimento o de novo) suggeriscono che il meccanismo con cui l’AFA induce cambiamenti epigenetici può influenzare preferenzialmente la metilazione de novo piuttosto che alterare la metilazione preesistente. Ciò probabilmente spiega i diversi comportamenti dell’AFA anche nei due modelli sperimentali. Inoltre, è noto che i due DNMT de novo (DNMT3A e DNMT3B) agiscono su diverse porzioni di DNA [ 33 ]. La diminuzione in uno (DNMT3A) e l’aumento nell’altro (DNMT3B) potrebbero essere il risultato della specificità dell’AFA nell’attivare un percorso rispetto a un altro.
Sulla base di questi risultati, possiamo confermare che l’effetto antinfiammatorio dell’AFA opera attraverso un meccanismo epigenetico. L’AFA può modulare la metilazione del DNA nelle cellule umane; tuttavia, sono essenziali ulteriori ricerche per comprendere appieno i meccanismi attraverso cui l’AFA influenza la metilazione del DNA e i suoi potenziali effetti terapeutici nei processi infiammatori.
Conclusioni
Il nostro studio rivela risultati significativi sull’impatto di Aphanizomenon flos-aquae (AFA) sulla metilazione del DNA nel contesto dell’infiammazione. Esaminando gli effetti di AFA sui modelli di metilazione del DNA durante condizioni infiammatorie, nel tessuto del colon di ratti e utilizzando cellule Caco-2, abbiamo scoperto che AFA potrebbe modulare la metilazione globale del DNA e la metilazione specifica del gene in modo diverso a seconda del modello sperimentale e del gene di interesse. In Più specificamente, il trattamento con AFA a seguito di uno stimolo infiammatorio ha causato ipermetilazione il più delle volte, stabilizzando potenzialmente il DNA e contrastando la demetilazione indotta dall’infiammazione. Abbiamo anche esplorato la metilazione dei promotori per i geni che codificano le interleuchine, rivelando che gli effetti di AFA sono specifici del sito e dipendono dal modello di trattamento. Ad esempio, il co-trattamento con AFA e IL1β ha influenzato significativamente la metilazione e l’espressione del gene IL6 , suggerendo una sensibilità differenziale dei siti di metilazione agli agenti esterni. Inoltre, l’AFA ha dimostrato effetti distinti sull’espressione di DNMT, indicando che la sua modulazione epigenetica può influenzare preferenzialmente i percorsi di metilazione de novo (Fig. 14 ).
Figura 14
Uno schema dei piani sperimentali che coinvolgono cellule Caco-2 differenziate co-trattate per 24 ore con lo stimolo infiammatorio (IL1β) e AFA e pre-trattate per 24 ore con lo stimolo infiammatorio (IL1β) e successivamente con AFA a diversa concentrazione per altre 24 ore. L’immagine mostra che AFA induce un’alterazione nei livelli di espressione delle DNA metiltransferasi (DNMT), portando di conseguenza a un’ipermetilazione globale del DNA. A un livello genico specifico, AFA induce ipometilazione dei geni IL8 e IL6, con conseguente aumento dell’espressione genica
Questi risultati suggeriscono per la prima volta la capacità delle microalghe di modulare la metilazione del DNA in modelli umani o animali, evidenziando un nuovo aspetto dell’interazione tra regni. I nostri risultati suggeriscono che l’AFA ha il potenziale per fungere da agente nutraceutico che mira alla regolazione epigenetica nei processi infiammatori. La ricerca futura è essenziale per chiarire ulteriormente i meccanismi sottostanti e il potenziale terapeutico dell’AFA.
Disponibilità dei dati
Durante lo studio attuale non sono stati generati o analizzati set di dati.
Abbreviazioni
AFA:
Microalga Aphanizomenon flos-aquae
DNBS:
2, 4-dinitrobenzensolfonico
MeSAP-PCR:
PCR arbitrariamente innescata sensibile alla metilazione
MSRE:
Endonucleasi di restrizione sensibili alla metilazione
DNMT:
DNA metiltransferasi
